A voluntarios adultos sanos se les tomó una muestra de sangre total, previa firma del consentimiento informado aprobado por el Comité de Ética de la Pontificia Universidad Javeriana. Posteriormente, se centrifugó la muestra para obtener el plasma y la fracción celular, a partir de la cual se separaron células mononucleares de sangre periférica, utilizando el gradiente de densidad de Ficoll Hypaque (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, Estados Unidos). Las células se lavaron dos veces con RPMI 1640 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) suplementado con L-glutamina (2 mm); penicilina (100 U/ml); estreptomicina (100 μg/ml; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD); y plasma autólogo al 1 % (medio completo) y resuspendidas en buffer fosfato-salino (PBS) con 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) más 0,5 % de albúmina humana (Biotest, Pharma, Dreieich, Alemania). Los monocitos se purificaron mediante separación inmunomagnética, usando selección positiva con microperlas CD14 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células CD14+ purificadas (mediana de pureza: 95 %; rango 91,3-99,2 %; n = 5) se usaron para originar CD.

Para la generación de CD inmaduras, las células CD14+ se cultivaron durante 6 días a una densidad de 1 millón/mL a 37 °C y 5 % de dióxido de carbono en medio completo más 1000 U/ml de GM-CSF e IL-4 (Prepotech, México). En el día 3 se reforzaron las citocinas a la misma dosis inicial. Todos los reactivos utilizados fueron negativos para la presencia de LPS, lo cual se verificó utilizando un kit comercial (BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD). Al día 6, el fenotipo de las CD inmaduras obtenidas se determinó mediante citometría de flujo usando el siguiente panel de anticuerpos: CD14-V500 (BD Biosciences; Clon M5E2; catálogo 561391): HLA-DR-PerCP Cy5.5 (BD Biosciences; Clon L243; catálogo 339194): CD83-PE (BD Biosciences; Clon HB15e; catálogo 556855) y CD86 (BD Pharmingen; Clon FUN-1; catálogo 555660).

Posterior a la tinción, las células se lavaron y fijaron con un 1 % de paraformaldehído (Electron Microscopy Sciences, Washington, PA), y fueron adquiridas en el citómetro de flujo LSRFORTESSA (BD Bioscience) y analizadas con el software FACSDiva versión 8.0. Se excluyeron las células muertas y los restos celulares por análisis de tamaño y granularidad. Así mismo, se ajustaron los parámetros de lectura del citómetro para la adquisición de los experimentos. Una vez obtenidas las CD inmaduras, estas se lavaron, contaron y cultivaron en medio completo sin plasma con 1000 U/ml de GM-CSF e IL-4 (Prepotech, México) y pretratadas durante una hora con sertralina o ciclodextrina o sertralina incluida en β-ciclodextrina a concentraciones previamente estandarizadas (10-20 μM). Posteriormente, se adicionó 1 µg/mL de LPS (LPS de Escherichia coli, serotipo 055: B5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos) como estímulo de maduración o su respectivo control PBS durante 24 horas. Como control positivo se tomaron las CD maduradas con LPS (CDLPS) y como controles negativos las CD tratadas con β-ciclodextrina solamente, con la sertralina solamente y con el vehículo en que se disolvieron los compuestos (agua).

El fenotipo de las CD maduras se determinó por citometría de flujo usando el mismo panel de anticuerpos ya descrito. Los resultados de la citometría para el fenotipo de las poblaciones de CD se reportaron en intensidad media de fluorescencia de cada marcador y la frecuencia de células que expresan una o combinaciones de los diferentes marcadores.

Los sobrenadantes de cada una de las poblaciones de CD se almacenaron a –20 °C hasta su uso. Los sobrenadantes se descongelaron y se realizó la determinación cuantitativa de IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70 y TNF-α mediante citometría de flujo, utilizando la técnica de microesferas del estuche comercial Cytometric Bead Array Human Inflammation Kit (BD Biosciences, San José, CA) junto con el análisis en el programa FCAP Array, versión de Windows. El límite de detección depende de cada citocina analizada y varía entre 1,9 y 7,2 pg/mL.

La pérdida de la viabilidad celular se monitoreó midiendo la liberación de la lactato deshidrogenasa en el medio de cultivo, utilizando un estuche comercial de Roche (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), siguiendo las indicaciones del fabricante.

Los análisis estadísticos se realizaron con el programa GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), usando pruebas no paramétricas. Las diferencias entre los datos no pareados y pareados se determinaron con las pruebas de Mann-Whitney y Wilcoxon, respectivamente. Una p < 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Las medianas de los experimentos se muestran, a menos que se especifique lo contrario.

Con el objetivo de determinar el efecto diferencial entre la sertralina y la sertralina incluida en la β-ciclodextrina en el fenotipo de las CD generadas in vitro a partir de monocitos, se evaluó la expresión de moléculas de superficie relacionadas con activación y diferenciación. Para ello, se aislaron y cultivaron monocitos CD14+ con citocinas de diferenciación durante seis días para obtener CD inmaduras, las cuales fueron pretratadas con sertralina o sertralina incluida en la β-ciclodextrina por una hora para posteriormente ser maduradas con LPS durante veinticuatro horas. Adicionalmente, se realizó un control positivo de CDLPS y como controles negativos solo las células tratadas, ya sea con sertralina, β-ciclodextrina o el vehículo en el que se disolvieron los compuestos solamente (CDI).

Cada una de las poblaciones se evaluaron para la expresión de CD14: HLA-DR y la coexpresión de CD83 y CD86, por citometría de flujo. Los controles negativos mostraron un comportamiento esperado reflejado en la baja frecuencia de células que expresan HLA-DR y coexpresan tanto CD83 como CD86. Ello reveló que los tratamientos, por sí solos, no generan maduración de las células (dato no mostrado). Caso contrario, las células maduradas, pero no pretratadas (CDLPS), presentaron una alta frecuencia asociada a HLA-DR, CD83 y una frecuencia mayor y estadísticamente significativa de células de coexpresan CD83-CD86, lo que es coherente con el fenotipo de CD madurada (figura 1). Al comparar las poblaciones pretratadas y maduradas respecto al control de maduración, se observó que no existen diferencias significativas en la frecuencia de células que expresan CD14: HLA-DR, CD83: CD86. Sin embargo, cuando se analizó la población madurada pretratada con β-ciclodextrina frente a la madurada solamente (CDLPS), se observó un incremento leve pero significativo en el número de CD que coexpresan CD83-CD86 asociado al tratamiento a la dosis de 20 mM (n = 5; p = 0,03).

Figura 1

CD: células dendríticas; CDLPS: célula dendrítica madurada com lipopolisacárico; SRT: sertralina; LF: β-ciclodextrina.

Para identificar las diferencias entre el perfil de citocinas secretadas por la población de CD pretratadas con sertralina o β-ciclodextrina, se midieron IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12p70, TNF-α y TGF-β1 en los sobrenadantes de cultivo (figura 3) de los experimentos descritos anteriormente. Para la población de CDI, es decir, aquellas tratadas únicamente con vehículo en el que se disolvieron los compuestos, se encontraron concentraciones similares en todas las citocinas evaluadas, que, como se esperaba, al ser comparadas con las obtenidas para la población madurada con LPS (CDLPS), revelaron una diferencia significativa (n = 5; p = 0,03). Al evaluar los niveles de citocinas en las diferentes poblaciones de CD maduradas no se observaron diferencias estadísticas en la producción de IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 y TNF-α. Sin embargo, el tratamiento con 20 µM de β-ciclodextrina, previo a la maduración, reveló un incremento significativo en el nivel de la IL-12p70, al ser comparado con el control de maduración (n = 5; p = 0,03).

Figura 3

CD: células dendríticas; CDLPS: célula dendrítica madurada com lipopolisacárico; SRT: sertralina; LF: β-ciclodextrina.