La diafanización o transparentación es una técnica de conservación anatómica que transparenta (despigmenta o aclara) los tejidos blandos para equilibrar el índice de refracción de la luz dentro de un organismo y fuera de este, y que tiñe (pigmenta) los tejidos mineralizados para visualizar los componentes óseos y cartilaginosos. El fundamento de la técnica se basa en: 1) fijar el espécimen con formol o alcohol mediante la formación de enlaces cruzados entre las proteínas y la inactivación de enzimas autolíticas para impedir la degradación post mortem de los tejidos y para mantener la citomorfología de las células; 2) llevar a cabo la diafanización propiamente dicha, con la cual se transparentan los tejidos blandos con una solución alcalina altamente corrosiva de hidróxido de potasio, que deshidrata los tejidos mediante una reacción de óxido-reducción; 3) teñir los tejidos mineralizados que quedaron expuestos en la diafanización con colorantes que tengan alta afinidad por los tejidos mineralizados, por lo general rojo de alizarina para tejido óseo y azul alcián (etanol y ácido acético glacial) para tejido cartilaginoso; y 4) conservar la muestra diafanizada con los tejidos mineralizados teñidos en una solución de glicerina y alcohol [1].

Esta técnica anatómica de observación de los tejidos mineralizados —dirigida principalmente a la tinción del tejido óseo con rojo de alizarina—, inicialmente, la desarrolló Schultze, en 1897 [2], y posteriormente la modificaron diferentes investigadores, como Mall, en 1906 [3]; Dawson, en 1926 [4]; Lipman, en 1935 [5]; Cumley y cols., en 1939 [6]; Gamble, en 1945 [7]; True, en 1947 [8]; Staples y Schnell, en 1964 [9]; Jensh y Brent, en 1966 [10], y Kawamura y cols., en 1990 [11] (figura 1).

Figura 1 Figura 1 Neonato de ratón preparado con la técnica de diafanización y tinción simple (rojo S de alizarina: tejido óseo) Fuente: modificado de Philbrick WM. Parathyroid hormone-related protein is required for tooth eruption [PowerPoint Slide for Teaching]. PNAS [internet]. 1998;95(20):11846-51. Disponible en: http://www.pnas.org/content/95/20/11846/F1.expansion.html

Finalmente, Simons y VanHorn, en 1971 [12]; Inouye, en 1976 [13]; Whitaker, en 1979 [14]; Kimmel y Trammel, en 1981 [15]; McLeod, en 1980 [16]; Boardman y cols., en 1984 [17], y Webb y Byrd, en 1994 [18], desarrollaron una técnica de doble tinción en la que, además de teñir el tejido óseo con rojo de alizarina, se incluyó la tinción del tejido cartilaginoso con azul alcián, lo que se constituyó en un método ideal para estudiar la osificación endocondral durante el desarrollo embrionario (figura 2). De igual forma, Williams, en 1941 [19], y Burdi, en 1965 [20], emplearon una técnica de doble tinción con rojo de alizarina y azul de toluidina.

Figura 2 Figura 2 Feto de ratón preparado con la técnica de diafanización y tinción doble (rojo S de alizarina [tejido óseo] y azul alcián 8 GX [tejido cartilaginoso]) Fuente: modificado de Sylva M, Li VSW, Buffing A, Van Es J, van der Born M, van der Velden S, Gunst Q. The BMP Antagonist Follistatin-Like 1 Is Required for Skeletal and Lung Organogenesis [figure 3]. PloS ONE [internet]. 2011;6(8). Disponible en: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0022616#pone-0022616-g003

A partir de Dawson, si bien la técnica de tinción de los tejidos mineralizados se ha mantenido, la técnica de diafanización se ha modificado con el propósito de corroer o macerar de una forma más eficiente los tejidos blandos. Así, en la actualidad, las técnicas de diafanización de mayor uso son la modificada de Dawson, en la que los tejidos son fijados y deshidratados en alcohol al 70 %, transparentados con hidróxido de potasio y aclarados con hidróxido de amonio y glicerina; y la de Dawson-Shultze, en la que los tejidos son fijados indistintamente en alcohol o en formol, y son transparentados en una solución de glicerina e hidróxido de potasio al 15 % [21].

Este perfeccionamiento de la técnica de diafanización y el empleo de la doble tinción ha permitido el estudio del desarrollo embrionario del sistema óseo de los vertebrados, debido al contraste que se genera entre los tejidos óseo y cartilaginoso durante la morfogénesis, a partir de los centros de osificación intramembranosa y endocondral. Ello permite, además, desarrollar estudios de embriología y anatomía comparadas, con lo cual se han determinado las implicaciones evolutivas de los vertebrados [22,23,24,25].

Además, la posibilidad de la técnica de diafanización ha resultado de gran utilidad, dada su relativa rapidez y bajo costo, para desarrollar estudios de teratogénesis por citotoxicidad a partir de la comparación de las anomalías congénitas del desarrollo del sistema óseo en diferentes biomodelos animales [14]. Se tiene como estándar la descripción con la misma técnica del desarrollo normal [26,27,28], de tal forma que se ha podido identificar en qué momento del desarrollo embrionario se evidencian las alteraciones morfofuncionales del hueso y el cartílago [29].

Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue revisar los reportes disponibles en la literatura especializada que han descrito el desarrollo embrionario del sistema óseo a través de técnicas de diafanización.

Se revisó literatura sobre el tema en las bases bibliográficas electrónicas PubMed, Google Académico y SciELO, a partir de la metodología PRISMA [30], a través de la asociación del término double staining con los descriptores en salud del Medical Subject Headings (MeSH) alizarin red, alcian blue, bone y cartilage, y la combinación con los operadores boleanos + y &.

Se incluyeron artículos que describen el desarrollo embrionario del sistema óseo a través de técnicas de diafanización y que emplean el método de tinción simple con rojo de alizarina para tejido óseo, o el método de tinción doble con rojo de alizarina para el tejido óseo y azul alcián para el tejido cartilaginoso. En total se seleccionaron 22 artículos identificados en las bases de datos electrónicas, por medio de los títulos, de los resúmenes y de las palabras clave, de los cuales se extrajeron los datos requeridos: autores, año, biomodelo mamífero, objetivo del estudio, técnica empleada y conclusión.

De acuerdo con la metodología PRISMA, se obtuvieron 443 artículos, de los cuales se excluyeron 401 (sin contar las referencias duplicadas), porque no describían el desarrollo embrionario del sistema óseo de mamíferos. De las 42 referencias tenidas en cuenta, 17 se excluyeron porque no describieron el desarrollo de los tejidos óseo y cartilaginoso a través de la técnica de diafanización con tinción simple o tinción doble (figura 3). Finalmente, se seleccionaron 22 artículos que cumplieron con los criterios de inclusión y cuya información fue organizada en la tabla 1.

Figura 3 Figura 3 Búsqueda de referencias de acuerdo con la metodología PRISMA

Tabla 1 Tabla 1 Organización de las referencias tenidas en cuenta según los criterios de inclusión

Tabla 1 (cont.) Tabla 1 (cont.) Organización de las referencias tenidas en cuenta según los criterios de inclusión

Tabla 1 (cont.) Tabla 1 (cont.) Organización de las referencias tenidas en cuenta según los criterios de inclusión

Tabla 1 (cont.) Tabla 1 (cont.) Organización de las referencias tenidas en cuenta según los criterios de inclusión

La osificación es un proceso del desarrollo embrionario de los mamíferos por el cual se conforma el tejido óseo (histogénesis) para constituir los huesos (morfogénesis). Dicho proceso ocurre por medio de dos vías: la osificación intramembranosa y la osificación endocondral. En la primera, el tejido óseo deriva directamente del mesénquima, como es el caso de la morfogénesis de los huesos planos; mientras que, en la segunda, el tejido óseo deriva de una plantilla de tejido cartilaginoso derivado del mesénquima, como es el caso de los huesos largos, los cuales siguen con su crecimiento y desarrollo durante la vida posnatal [43].

En el caso de la osificación endocondral, células del mesodermo en presencia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y proteína morfogénica de hueso (BMP) se diferencian a células condroprogenitoras y estas, a su vez, a condroblastos, los cuales se agrupan en un centro de condrificación, secretan la matriz extracelular cartilaginosa y quedan atrapados en esta, para diferenciarse en condrocitos. Una vez queda constituida una plantilla de cartílago hilaino, esta crece por aposición (desde el pericondrio) o de forma intersticial (desde los grupos isógenos). Posteriormente, células mesodérmicas indiferenciadas del pericondrio se diferencian a células osteoprogenitoras, que dan paso al periostio. De allí, los condrocitos del cartílago hialino se hipertrofian y empiezan a secretar fosfatasa alcalina para cambiar el pH, de tal forma que las células osteoprogenitoras se diferencian en osteoblastos, los cuales cambian la matriz extracelular cartilaginosa a matriz extracelular ósea (osteoide) y luego depositan fosfatos y calcio para mineralizar dicha matriz, lo que ocasiona que los condrocitos atrapados experimenten muerte celular programada al imposibilitarse su nutrición por agua de solvatación difundida desde lo que era el pericondrio. Este proceso, gradual y muy regulado, ocurre durante el desarrollo embrionario y el crecimiento y desarrollo posnatal, de tal forma que la plantilla de cartílago es totalmente remplazada por tejido óseo con la excepción del cartílago articular [43,44,45,46,47].

Por supuesto, este proceso puede verse afectado por diferentes factores genéticos y medioambientales (teratógenos) durante los diferentes niveles de diferenciación, razón por la cual se hizo fundamental estandarizar el desarrollo normal de la formación de tejido cartilaginoso desde el mesodermo (condrogénesis) y la formación de tejido óseo desde el tejido cartilaginoso (osteogénesis) a través de la osificación endocondral. Con este fin, la técnica de diafanización y tinción simple con rojo de alizarina desarrollada inicialmente por Schultze, Mall y Dawson, les ha permitido a diferentes investigadores describir el tejido óseo durante el desarrollo embrionario y posnatal [21,31,32,34,37,38,41], debido a que esta tinción tiene gran afinidad (en un pH básico) por los depósitos de calcio de la matriz extracelular ósea mineralizada [48].

Sin embargo, fue necesario incorporar otra técnica de tinción que permitiera contrastar el tejido cartilaginoso precursor de la osificación endocondral, de tal forma que todo el proceso se hiciera visible desde la condrogénesis. El azul alcián cuenta con una gran afinidad por los glucosaminoglicanos (en un pH ácido) [49], los cuales abundan en la matriz extracelular cartilaginosa, principalmente en el matriz territorial alrededor de los condrocitos. Con ello, Simons y VanHorn e Inouye desarrollaron una técnica de diafanización y tinción doble, rojo de alizarina para el tejido óseo y azul alcián para el tejido cartilaginoso, usada por diferentes autores para describir el proceso de osificación endocondral [13,14,15,16,17,18,24,25,29,33,35,36,39,40,42].

Finalmente, y debido al bajo costo de la técnica, la fácil estandarización del protocolo técnico y lo relativamente rápido de la obtención de resultados, la diafanización y tinción simple o doble se ha constituido en uno de los procedimientos de elección para estudios de toxicidad y acción teratógena durante los estudios experimentales de diferentes agentes de la industria agrícola, avícola, manufacturera y farmacológica, en lo referente al desarrollo embrionario del sistema óseo en biomodelos animales [1,18,37,38,39,50].

Esta revisión hace un recorrido de la literatura especializada desde el origen de la técnica, las modificaciones del protocolo y sus posibles aplicaciones.

La diafanización y tinción simple o tinción doble es una técnica anatómica de estudio (versátil y de bajo costo) del sistema óseo durante su desarrollo embrionario y posnatal, la cual permite contrastar el tejido cartilaginoso y del tejido óseo durante el proceso de osificación endoncondral. De esta forma, la técnica descrita puede emplearse en estudios de 1) descripción del desarrollo del sistema esquelético con fines pedagógicos; 2) correlación de la aparición de los centros de condrificación y de osificación con el crecimiento y desarrollo del organismo; 3) análisis de la correcta formación del cartílago (condrogénesis) y del hueso (osteogénesis); 4) estandarización de biomodelos vertebrados de desarrollo del sistema esquelético para estudios de embriología y de anatomía comparada; y 5) estandarización de biomodelos mamíferos para el estudio de anomalías congénitas de origen medioambiental ante la exposición de un posible agente teratogénico.