El cáncer colorrectal (CCR) es una entidad multifactorial con factores de riesgo genéticos y ambientales. Es una enfermedad comúnmente originada a partir de la proliferación de células epiteliales displásicas de la mucosa del colon y el recto, cuya principal presentación es el adenocarcinoma (1). Según GLOBOCAN 2020, el CCR es el tercer cáncer más diagnosticado en el mundo, con una incidencia del 10% (2). Su incidencia es mayor en hombres respecto a las mujeres, especialmente en países desarrollados, y a medida que el índice de desarrollo aumenta en cada país, también aumenta la incidencia del CCR (2). En cuanto a la mortalidad, el CCR se ubica en el segundo puesto, con aproximadamente 935000 muertes estimadas para el 2020; el cáncer de colon, en el quinto lugar, con el 5,8% de todas las muertes por cáncer, y el cáncer de recto, en el octavo puesto, con el 3,4% de todas las muertes por cáncer (2).

Anteriormente, con frecuencia, esta patología se asociaba con pacientes mayores de 50 años, pero ahora los reportes indican una mayor aparición en población joven y adultos menores de 40 años (3). Si bien se han descrito factores de riesgo como la presencia de algún familiar de primer grado con antecedente de CCR, que implica un riesgo de dos a cuatro veces mayor para la persona, el sobrepeso, el tabaquismo, la alta ingesta de carnes rojas y el sedentarismo también se han identificado como posibles factores de riesgo, aunque no se detecta una causa particular para este cambio epidemiológico (4,5).

En Colombia, el CCR constituye la cuarta causa de mortalidad por cáncer, con una incidencia aproximada de 16 casos por cada 100000 habitantes para el 2021 (6). En su etiología, el componente genético desempeña un papel importante, pues más del 80% de todos los casos de adenomas son iniciados por mutaciones en el gen APC (Adenomatous polyposis Coli), lo que se constituye en el primer evento de desarrollo de adenocarcinomas, que corresponden al 98% de los casos de CCR. Además, las mutaciones germinales en genes de la vía de la reparación de mal apareamiento (MMR, por sus siglas en inglés) también están involucrados en la patogénesis del CCR hereditario no polipósico, lo que evidencia la predisposición genética y familiar en esta patología (7,8). En relación con el pronóstico, el estado del tumor es el factor más importante, y los procedimientos más empleados para la estadificación del CCR son ultrasonido endoscópico, escáner abdominal y exploración quirúrgica. En el caso de tumores bien diferenciados, la histología tumoral con estadio IV (cualquier T, cualquier N, M1), donde ya se muestra metástasis, permite determinar una sobrevida de cinco años. En cuanto al tratamiento, se puede clasificar como sistémico y localizado. Para el sistémico se encuentra disponible la quimioterapia, la inmunoterapia y la terapia dirigida, que se consideran en pacientes con enfermedad avanzada (9). El tratamiento local se refiere a las intervenciones dirigidas a la extracción del tumor: cirugía, ablación, embolización y radioterapia; estos se pueden emplear en cualquier estadio de la enfermedad (9,10).

Teniendo en cuenta la alta mortalidad y baja sobrevida del paciente con CCR, aun cuando se ha manejado con las terapias tradicionales ya mencionadas, se hace hincapié en la necesidad de enfoques terapéuticos alternativos que permitan abarcar la complejidad de los mecanismos genéticos moleculares y las limitaciones en los tratamientos actuales para el CCR (11). Para ello se han propuesto las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas, conocidas como CRISPR-Cas9 (CRISPR associated protein 9), por sus siglas en inglés, como una estrategia de terapia genética prometedora por su capacidad para desactivar genes mutados, reparar genes y regular la transcripción génica (12,13), aunque hasta la fecha no hay evidencia de estudios clínicos que lo corroboren.

Recientemente, datos de un ensayo clínico de fase 1 (diseñado para probar la seguridad y viabilidad) sobre los primeros pacientes con cáncer (dos con mieloma refractario avanzado y uno sarcoma metástasis) tratados con células T modificadas con CRISPR-Cas9 mostraron como resultado un injerto duradero de hasta nueve meses, con ediciones en tres loci genómicos (TRAC, TRBC y PDCD1) que potencian la capacidad de reconocimiento de las células tumorales para combatirlas con la respuesta inmune reprogramada, y reportaron que no hubo reacciones negativas en ninguno de los tres tratados (14). Ello sugiere que la inmunogenicidad es mínima en las condiciones brindadas para el estudio y demuestra la viabilidad de la edición con CRISPR para la terapia del cáncer, especialmente en los casos de tumores sólidos que no responden a la inmunoterapia (14).

En cuanto al CCR, los estudios se han centrado en la experimentación in vivo en modelos murinos e in vitro en líneas celulares. Igualmente, se reportan distintas investigaciones sobre las cuales se observa un posible efecto benéfico de esta técnica para combatir el CCR. Por ello, el objetivo de esta revisión de tema es brindar una descripción genética y molecular del CCR e identificar los avances del CRISPR/Cas en relación con su aplicación diagnóstica y posible potencial terapéutico en el CCR, de acuerdo con la literatura publicada en español e inglés entre 2014 y 2021 en las bases de datos de PubMed, Web of Science, SciELO y Google Scholar, con los términos CRISPR-Cas9, cáncer, cáncer colorrectal. terapia génica.

La predisposición genética del CCR es del 6% al 10% cuando se asocia con mutaciones de línea germinal de penetrancia alta, que corresponde en el 70% de los casos a mutaciones somáticas (8,15). Ahora bien, la expresión de estas mutaciones permite identificar la histología tumoral y los fenotipos moleculares que van a permitir orientar el diagnóstico y el tratamiento. De acuerdo con lo anterior, a continuación se mencionan los síndromes hereditarios de CCR.

Los síndromes hereditarios del CCR se dividen fenotípicamente en síndromes con y sin poliposis, según el número y la histología de los pólipos colorrectales (16). Los síndromes hereditarios asociados con pólipos, a su vez, se dividen en adenomatosos y hamartomatosos. Dentro de la clasificación de síndromes adenomatosos, existe la poliposis adenomatosa familiar, con un patrón de herencia autosómico dominante y vinculada con variantes patógenas de la línea germinal en APC (8,17); además, se asocia con tumores en el tracto gastrointestinal superior y manifestaciones extraintestinales, como cáncer papilar de tiroides (18, 19). Asimismo, está la poliposis asociada a la corrección de lectura de la polimerasa, causada por variantes patógenas en los dominios de exonucleasa de POLE (DNA Polymerase Epsilon) y POLD1 (DNA Polymerase Delta 1), que tienen un patrón de herencia autosómico dominante (20).

En cuanto a la poliposis asociada a MUTYH (MutY DNA glycosylase), de patrón autosómico recesivo, el 93% corresponde a mutaciones Y179C y G396D. Así, tienen un riesgo mayor para CCR los portadores monoalélicos de Y179C, comparado con los portadores de G396D (21). No obstante, también encontramos la poliposis mixta, cuya causa genética viene de variantes de la línea germinal de GREM1 (Gremlin 1, DAN Family BMP Antagonist), implicada en la secreción de la proteína Gremlin, particularmente identificada en poblaciones suecas y de descendencia judía asquenazí (20). También está la poliposis serrada, dada principalmente por mutaciones de la línea germinal en el gen supresor de tumores RNF43 (Ring Finger Protein 43), así como las mutaciones en los genes GREM1 y MUTYH (22,23).

Respecto a los síndromes de poliposis hamartomatosa, estos exhiben un patrón de herencia autosómico dominante e incluye el síndrome de Peutz-Jeghers, el síndrome de poliposis juvenil y los síndromes tumorales PTEN (Phosphatase and Tensin Homolog)(8). El primero se debe a variantes en la línea germinal y se asocia con cáncer del tracto gastrointestinal superior, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer del cordón sexual (24). El síndrome de poliposis juvenil se da por variantes en BMPR1A (Bone Morphogenetic Protein Receptor Type 1A) y SMAD4. Por último, los síndromes tumorales PTEN se asocian con variantes de la línea germinal PTEN, que tiene múltiples fenotipos y, por tanto, heterogeneidad clínica, que se puede presentar a manera de hamartomas gástricos y colorrectales, pólipos hiperplásicos, lipomas y ganglioneuromas, entre otros (8,25).

Aunque los síndromes del CCR asociados con fenotipos de poliposis son los más fáciles de reconocer, la gran mayoría de los individuos afectados por la predisposición genética al CCR no presentan pólipos múltiples (8). Los síndromes no asociados a poliposis se subclasifican según el fenotipo molecular del tumor: deficiente en la reparación de errores de apareamiento del ADN (MMR-d) o proeficiente (MMR-p) (8). Dentro de las mutaciones en MMR-d está el síndrome de Lynch, relacionado con variantes en la línea germinal o epimutaciones en los genes de reparación de errores de apareamiento del ADN: MLH1 (MutL Homolog 1), MSH2 (MutS Homolog 2), MSH6 (MutS Homolog 6) y PMS2 (Postmeiotic Segregation Increased 2), siendo estas últimas las más prevalentes en la población general (26). En cuanto al componente MMR-p, el riesgo de padecer CCR disminuye el doble y solo se ha mostrado asociación con el gen RPS20 (Ribosomal Protein S20), por la alta penetrancia de sus mutaciones (8,27).

Actualmente, estudios de secuenciación genómica a gran escala han identificado otros genes que con poca frecuencia mutan en CCR esporádico y revelan la alta heterogeneidad genética inter- e intratumoral en tejidos cancerosos (28). Por ello, los modelos de progresión de genes se están remplazando por modelos orientados a las vías de señalización desreguladas en CCR.

Se han encontrado múltiples vías de señalización importantes en la proliferación, metabolismo, diferenciación, supervivencia celular y rutas de apoptosis, que, cuando se encuentran alteradas, generan mayor susceptibilidad al CCR. Algunas de las vías relacionadas son Wnt/APC/β-catenina, PI3K/AKT, NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) y Ras/Raf (15). La vía Wnt/β-catenina es la que se afecta más frecuentemente en el CCR esporádico (15), y se ha observado que la hiperactivación de esta vía contribuye tanto al inicio como a la progresión del CCR, relacionándose con múltiples causas, como mutaciones en la proteína APC y AXIN (29, 30). Asimismo, otra vía involucrada en el desarrollo del CCR, tanto esporádico como hereditario, es la de PI3K/AKT/PTEN, que puede encontrarse disfuncional o hiperactiva y es responsable de múltiples actividades celulares, como la activación del crecimiento celular y la inhibición de la apoptosis, diferenciación y migración celular (15).

Respecto a la vía del NF-κB, esta se correlaciona con el CCR, debido a su papel en los mecanismos de proliferación, inflamación celular y angiogénesis, que favorecen el desarrollo tumoral (31). Por otra parte, la vía de señalización Ras/Raf, implicada en procesos de fosforilación de proteínas (15, 29), favorece procesos de proliferación celular, supervivencia prolongada, angiogénesis, evasión apoptótica y metástasis, que llevan a la transformación celular maligna y progresión tumoral (29).

Existen muchas otras vías relacionadas con el desarrollo de esta enfermedad de menor forma. Sin embargo, conocer las vías de señalización más importantes involucradas en el desarrollo del CCR y cómo estas se asocian resulta de suma importancia, debido a que se logra comprender el inicio y la progresión de esta patología, para lograr relacionarlo con el desarrollo de posibles terapias, pronósticos y respuestas a tratamientos.

El sistema CRISPR-Cas9 es una herramienta prometedora de edición del genoma que tiene potencial terapéutico contra los trastornos genéticos incurables. Comprende una serie de componentes esenciales para la introducción de cambios o ediciones precisas en secuencias de ADN blanco (figura 1A). Uno de estos elementos es la endonucleasa Cas9, que corta las dos cadenas del ADN en un sitio particular del genoma. Otro elemento clave es el ARN guía (ARNg), que es una secuencia prediseñada de ARN (alrededor de 20 nt complementarios al ADN blanco), situada dentro de un marco de ARN largo (32,33). En relación con el mecanismo de acción, la enzima Cas9 sigue al ARNg hasta la secuencia blanco. Este complejo tiene dos dominios catalíticos (HNH y RuvC) que actúan juntos para mediar las roturas en el ADN. Cada uno de estos dominios catalíticos escinde una cadena de ADN, lo que da como resultado dos roturas proximales a la secuencia de PAM (Protospacer adjacent motif) en el sitio objetivo (34), para luego inducir procesos de reparación del ADN. Estas roturas de doble cadena generalmente se reparan mediante una de dos vías. Una vía tiene que ver con intentar reparar el daño mediante la unión de extremos no homólogos, propensos a errores, y la otra vía a través de la reparación dirigida por homología, la cual durante el proceso de reconstrucción del ADN escindido usa el ADN homólogo del donante para introducir cambios dentro de uno o más genes en el genoma de la célula de interés (32). Es de mencionar que, en comparación con otras técnicas de edición del genoma, CRISPR-Cas9 es una técnica de fácil uso, flexible, altamente eficiente y específica (33,34).

Figura 1

PAM: protospacer adjacent motif.

En CCR son diversas las mutaciones que confieren capacidades tumorigénicas a las células intestinales, lo que se manifiesta en una gran cantidad de alteraciones celulares adicionales que dificultan el tratamiento adecuado y preciso. Debido a ello, el bloqueo de genes únicos a veces resulta inefectivo, por las diferentes combinaciones genéticas en CCR (38). En este contexto, se han realizado varios estudios con CRISPR, principalmente para comprender las distintas vías asociadas con la gran cantidad de genes implicados en el CCR (39). Por ello, oncogenes como KRAS y el NRAS, genes supresores de tumores como PTEN y el SOX15 (SRY-Box transcription factor 15) y genes de resistencia a medicamentos como el ZEB1 (Zinc Finger E-Box Binding Homeobox 1) y el MIR139-5p (MicroRNA 139) han sido blancos de CRISPR en CCR (40). Adicionalmente, el uso de esta técnica ha brindado nuevas aproximaciones a la comprensión de genes como el CCAT1 (Colon cancer associated transcript 1), el cual se observa sobreexpresado no solo en adenocarcinoma de colon, sino también en cáncer ovárico y carcinoma hepatocelular, y se ha asociado con procesos de proliferación celular, migración y metástasis (41).

En este sentido, el CRISPR-Cas9 ha permitido identificar nuevos genes relacionados con el CCR que permiten dilucidar aspectos aún desconocidos en esta patología (30). Un ejemplo de esto corresponde a la modulación de la vía de la Wnt/β-catenina, la cual hasta el momento ha mostrado ser inefectiva, particularmente por sus múltiples vías subyacentes que aún se desconocen (39). Sin embargo, Wan et al. (39), usando CRISPR-Cas9 en líneas celulares y cultivos organoides, lograron observar nuevos reguladores como las proteínas KMT2A/Mll1 (histone lysine methyltransferase 2A oncoprotein/mixed-lineage leukemia 1), reguladoras de la ocupación de la cromatina de β-catenina y el rendimiento transcripcional, implicada en la vía de Wnt/β-catenina (39).

Por otro lado, Evron et al. (42) identificaron implicaciones de la helicasa DHX29 (DEAD/H box RNA helicase 29) en la inhibición de la ruta de la Wnt en pacientes con CCR y aportaron a la literatura el papel de las helicasas en la regulación de esta cascada (42). De igual forma, Haiwen Li et al. (43) detectaron por medio CRISPR una asociación entre la sobreexpresión del gen de LGALS2, que codifica para la proteína de unión a glicanos Gal2 (Galectin 2), y la disminución en la proliferación de células epiteliales de tumor de colon. En dicho estudio se demostró que los ratones knockout Gal2 desarrollaron tumores significativamente más grandes respecto a los ratones silvestres, usando un modelo de CCR inducido por azoximetano/dextrano sulfato de sodio, destacando el potencial terapéutico del Gal2 en el CCR (43).

Wang et al. (44) reportaron en su estudio que la edición cuádruple de los genes KRAS, MEK1 (Mitogen-activated protein kinase kinase), PIK3CA y MTOR, mediada por adenovirus como vector del CRISPR, redujo de manera significativa el crecimiento tumoral de células del CCR con mutación KRAS. Esos resultados también permitieron inferir una alta especificidad y baja toxicidad del sistema de edición cuádruple; sin embargo, dadas las características hepatotóxicas del vector, es necesario seguir explorando la aplicación clínica del sistema para el tratamiento del CCR y otros tipos de cáncer (44).

Otros autores como Boos et al. (45) plantean una posible asociación entre la expresión del KRAS a la resiliencia contra terapias combinadas. En su estudio con organoides derivados de pacientes con CCR, han planteado la posibilidad a futuro de realizar terapias guiadas en el CCR, sugiriendo la aplicabilidad del CRISPR para poder identificar posibles riesgos o complicaciones en la administración de ciertas terapias (45).

Por otra parte, la multirresistencia a las terapias tradicionales se ha reportado ampliamente en el CCR, y corresponde a una causa importante de fallo terapéutico. Lei et al. (46) hacen uso de CRISPR/Cas9 para dirigirse a los ABC (transportadores dependientes de ATP), evitando su sobreexpresión y previniendo la salida del fármaco de quimioterapia en células de CCR. Dicho grupo de transportadores, particularmente el ABCB1/P-gp, reduce las concentraciones del fármaco intracelular, disminuyendo como consecuencia su efectividad (46). De igual forma, Li et al. (47) comprobaron por medio de experimentación in vitro que el CRISPR-Cas9 puede usarse para inhibir la proteína Par3L (Partitioning defective 3-like protein), asociada con una baja supervivencia en células tumorales colorrectales, mediante la inducción de la apoptosis, la activación de la cascada de señalización LKB1/AMPK (Liver kinase B1/AMP-activated protein kinase) y la inhibición de la proliferación celular, al tiempo que las células cancerosas mostraron mayor sensibilidad a quimioterapia e irradiación (47).

Caso similar exponen O’Cathail et al. (48) en su estudio, donde se describe la participación de la vía de señalización de NFR2, hasta hace poco estudiada en CCR, por medio de ensayos en líneas celulares radiorresistentes y radiosensibles utilizando CRISPR-Cas9 (48). En su estudio precisan que la activación de dicha vía contribuye a los procesos de quimiorresistencia y radiorresistencia; mientras que su inhibición sensibiliza las células ante dichos tratamientos (48). De la misma manera, Yu et al. (49) encontraron que el miR-5197 contribuye a mejorar la sensibilidad de las células de CCR a la radioterapia, por lo que resulta de suma importancia al observar que el 50% de los pacientes con CCR pueden presentar resistencia a esta (49).

El estudio de glucoproteínas también se ha evaluado dentro de su implicación con el CCR. En estudios con CRISPR-Cas9 sobre el bloqueo de genes implicados en la expresión de CD133 (Prominin 1) se ha encontrado una clara inhibición de la migración celular y la invasión de células en CCR (50). Igualmente, se observó que este proceso de bloqueo también generó una pérdida de la vimentina, la cual refleja la transición epitelio-mesénquima en el cáncer (50). Por igual, Watanabe et al. (51) encontraron por medio de esta técnica una asociación entre la CD166 (Cluster of differentiation 166) y la TP53. Afirmaron que la primera puede afectar a la segunda, promoviendo estados tumorogénicos, quimiorresistencia, invasión celular y proliferación celular (51). Se reconoce entonces que la CD166 se asocia con mal pronóstico y un progreso clínico-patológico mayor, pues se ha observado hasta en un 30,6% de los casos de CRC (52).

Así mismo, se han estudiado los procesos de fucosilación, los cuales, al observarse aumentados en el organismo, son indicativos de presencia de células cancerosas, particularmente en la zona colorrectal, y se asocian con mayor progresión tumoral, metástasis y resistencia a la quimioterapia (53). Blanas et al. (53) determinaron por medio de la activación de genes transcriptores de las FUT4 (Fucosyltransferase 4) y FUT9 (Fucosyltransferase 9), utilizando CRISPR en una población de células murinas con CCR y sin presencia de FUT4 ni FUT9, que existe una asociación directa entre la presencia de niveles elevados de estas proteínas con la presencia de antígeno de Lewis fucosilado, al igual que otros procesos implicados en la aparición del CCR. Se conoce que la sobreexpresión de FUT4 se asocia con la resistencia de la quimioterapia contra fármacos como el cetuximab o el bevacizumab (54). Por otro lado, se ha visto que la sobreexpresión de FUT9 favorece la actividad celular tumoral, mientras que su supresión favorece la agresividad tumoral y el crecimiento tumoral masivo (55). Por otro lado, la sobreexpresión del antígeno de Lewis se ha vinculado con la sobreexpresión de los distintos FUT que permiten la formación de este, ya que se ha observado en el 40%-50% de los casos de malignidad gástrica o colorrectal (56).

Finalmente, Durán-Vinet et al. (57) reportaron el CRISPR/Cas como un nuevo método de detección de ácidos nucleicos que permite el diagnóstico y pronóstico temprano del CCR a través de la medición de biomarcadores en saliva y sangre. Teniendo en cuenta lo anterior, se han utilizado las endonucleasas Cas12 y Cas13, que amplifican intrínsecamente la señal de detección mediada por su actividad transcolateral; sin embargo, el Cas13 cumple mejor los requisitos de diagnóstico basados en micro-ARN para un diagnóstico y pronóstico temprano del CCR (58). Además, Bender et al. (58) explican que el Cas13 se une y escinde los sistemas de interferencia del ARN; mientras que el Cas9 se une a los sustratos del ADN y carece de un dominio DN-asa, haciendo que sea una mejor alternativa, capaz de cambiar el fenotipo por alteración del ARN sin alterar el ADN (59).

Está claro que, en la actualidad, las investigaciones sobre la aplicación de CRISPR para combatir el CCR son pocos y se encuentran en estado de experimentación in vitro e in vivo. Sin embargo, los estudios reportados en este artículo han permitido reconocer nuevos genes y proteínas que intervienen en el desarrollo de este tipo de cáncer (véanse figuras 1B y 1C). Si bien hasta el momento los estudios se basan en modelos murinos y estudios in vitro, sin presencia de ningún estudio clínico que demuestren el espectro terapéutico del CRISPR, las investigaciones brindan nuevas oportunidades para dilucidar las vías moleculares que a futuro pueden ser blancos terapéuticos en el ámbito clínico (60).

El CCR es una enfermedad que se ha estudiado ampliamente, dada su alta incidencia y mortalidad en todo el mundo. Si bien se han reconocido factores de riesgo que predisponen su aparición, aún siguen en estudio muchos de sus genes y vías de señalización implicadas en su comportamiento tumoral. De esta manera, se han planteado nuevas terapias que buscan dirigirse al paciente que se está tratando. En este sentido, la terapia génica por medio del sistema CRISPR-Cas9 se ha utilizado para modular la expresión de mutaciones implicadas, de manera directa o indirecta, con el desarrollo del CCR y ha permitido de esta forma la comprensión del cáncer y sus posibles implicaciones terapéuticas.

Aunque se han desarrollado diversos estudios in vivo e in vitro en la población murina, hasta el momento no se han desarrollado estudios en humanos que demuestren la utilidad de estas terapias. Debido a lo anterior, el uso de CRISPR-Cas9 como parte de la terapia para el manejo de pacientes con CCR aún no se ha mostrado dentro del espectro de aplicabilidad clínica. No obstante, brinda nuevas herramientas que permiten tanto vislumbrar los distintos procesos implicados en el CCR que favorecen la tumorigenicidad, la quimiorresistencia, la invasión celular y la proliferación celular como identificar procesos patogénicos y analizar el uso diagnóstico de esta herramienta.

Por lo pronto, el CRISPR-Cas9 se muestra como un método de análisis y estudio para el CCR, pudiendo a futuro brindar pautas terapéuticas basadas en la medicina de precisión. Hasta el momento, no se encontraron ensayos clínicos que permitan identificar las propiedades terapéuticas de CRISPR en CCR en humanos. Desafortunadamente, no hay ensayos clínicos que permitan identificar las propiedades terapéuticas del CRISPR en eñ CCR en seres humanos. Por esta razón, es necesario incentivar la investigación en el tema, con el propósito de aumentar el conocimiento teórico no solo en modelos animales, sino en humanos y promover nuevos estudios clínicos, haciendo uso de esta técnica genética, que puede brindar una oportunidad terapéutica para el grupo de pacientes con CCR.

Todos los autores declaran que la investigación fue realizada en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera ser interpretada como un posible conflicto de intereses.